ADN-BIOINFORMÁTICA

ADN-BIOINFORMÁTICA

Objetivo

El objetivo de esta práctica es estudiar la herramienta BLAST bioinformatics. Lo primero que haremos es leer las autorradiografías de secuenciaciones automáticas de geles. A continuación se analizan los datos resultantes utilizando las bases de datos públicas de BLAST para identificar los genes y productos genéticos. 

Materiales

• Un juego de 4 tiras de autorradiografías 

• Un ordenador con acceso a internet
• Caja de luz blanca 

Procedimiento 

-Ejercicio 1 

Utilizaremos la tira de la secuencia 1 

1. Comenzar en la flecha y leer hacia arriba el gel durante 20 nucleótidos. Escribir la secuencia de ADN. Buscar la secuencia en la base de datos del NCBI utilizando el programa BLASTN.

La secuencia es: ACAAATAGTTACCTTGGAAC

2. Comenzar en la flecha y leer hacia arriba el gel durante 30 nucleótidos. Escribir la secuencia de ADN. Buscar la secuencia en la base de datos del NCBI utilizando el programa BLASTN.

La secuencia es: ACAAATAGTTACCTTGGAACATCAAACGGA

Preguntas y resultados: 

a. ¿Los resultados obtenidos con BLASTN para la primera y la segunda búsqueda se parecen entre sí?
Los valores de las dos secuencias se parecen mucho entre sí, son casi idénticas
 b. ¿Cuál es el nombre de este gen?
Factor de replicación C

 c. ¿A qué organismo es probable que pertenezca la secuencia de ADN de este ejercicio?

Mus musculus ( ratón doméstico)

-Ejercicio 2 

Utilizaremos la tira de la secuencia 2 

1.Comience el ejercicio mediante la lectura de la secuencia de ADN de la muestra #2, aproximadamente 6 cm desde la parte inferior de la tira. Los primeros 12 nucleótidos deben ser: 5'...GGACGACGGTAT...3'.

2. Buscar la secuencia en la base de datos del NCBI utilizando el programa BLASTN.

3. Después de obtener los resultados del programa BLASTN, desplácese hacia abajo a la sección de Alineamiento y mirar las entradas que tienen nucleótidos que coinciden con su secuencia de consulta. 

Preguntas y resultados: 

a. ¿Cuál es el nombre de este gen?
UEV y dominios del lactato/malato deshidrogenasa

 b. ¿Cuál es la cadena simple que representa la secuencia de consulta? ¿Cuál es la cadena simple que representa la secuencia “hit”? 

La secuencia de consulta representa la cadena simple positiva (la introducida). La secuencia hit representa la cadena negativa (la inversa a la complementaria)

Ejercicio 3 

Utilizaremos la tira de la secuencia 3 

1. Lea la secuencia de ADN de la muestra #3. Comenzar desde la parte inferior de la banda y escribir la secuencia de ADN.

 2. Buscar la secuencia en la base de datos del NCBI utilizando el programa BLASTN. 

3. Haga clic en el número de acceso de GenBank de la secuencia hit para acceder a más información sobre la secuencia de ADN y/ gen.

La secuencia es: GATTTGTAATGTAAGTGAATAAGGAATACCATCTAGTTCAAAGAGAAAATGTAATTTTGAATGTGAATTATCTGTATGAAACATGAAGTATACCTACTGAACCCTGAAACATGCATGTCTAGATTTGCTTTTGTCCAATCCAGCCTGTTTGCAATCACTTCCTACTCAATATCCANGNNCGTNATNCTNTAGCTNAGGTGCATGGTGCGCACTNGNNNTGTCNCTNCGGTNGTNNNGCAGCAATGTTGCGTTCCATTCAGTAAAACGTACTGTGGAGTTCNGTGGACTNNNNNNNNNNNN

Preguntas y resultados:

a. ¿Cuál es el nombre de este gen?
Rho GTPasa activadora de la proteína 5

 b. ¿Cuántas pares de bases, aproximadamente, tiene este gen?
7933 pb

Ejercicio 4 

Utilizaremos la tira de la secuencia  4 

En esta sección se muestra la interacción de dos proteínas codificadas por dos genes. Las interacciones proteína-proteína desempeñan un papel fundamental en prácticamente todos los procesos en una célula viva

1. Lea la secuencia de ADN obtenido de la muestra #4. Comenzar desde la parte inferior de la banda y escribir alrededor de 30 pares de bases de la secuencia de ADN.

 2. A continuación, suba alrededor de un tercio de la altura de la tira (~ 14 cm) y leer una parte de esta sección de la secuencia de ADN. 

3. Para este ejercicio limitar la búsqueda a la base de datos de genes humanos. Para ello vaya a "Choose Search Set” (Elija conjunto de búsqueda) y seleccione "Human genomic + transcript” (Genóma humano + transcripción). Ver Guía para el uso de BLASTN, punto 7. 

4. Buscar cada sección de la secuencia de forma individual en la base de datos del NCBI utilizando el programa BLASTN. 5. Una vez haya identificado el nombre de estos dos genes, realice una búsqueda general de Internet para recoger más información acerca de las dos proteínas. 

La secuencia es: ACAGCTTGGGTGGTCATATGGCCATGGAGC







La misma secuencia, pero 14 cm más arriba

Preguntas y resultados: 

a. Este ejercicio contiene dos secuencias de ADN (desde la sección inferior y a partir de la sección central). ¿Cuáles son los nombres de los genes correspondientes a estas dos secuencias? 
La primera secuencia de ADN es la de Bai 1. La segunda secuencia es la de Rac 1

b. ¿Cuáles son las funciones de las dos proteínas codificadas por estos genes? 
La secuencia Bai1 codifica BAI1, un inhibidor de la angiogénesis específica del cerebro. La angiogénesis implica el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos pre-existentes, es un proceso normal en el crecimiento, desarrollo y cicatrización de heridas. Sin embargo, la angiogénesis también ha demostrado ser esencial para el crecimiento y la metástasis de tumores sólidos. Con el fin de obtener el suministro de sangre para su crecimiento, las células tumorales son potentemente angiogénicas. La BAI1 se cree que inhibe el nuevo crecimiento de las células de los vasos sanguíneos, por lo que suprime el crecimiento de los glioblastomas (tumores cerebrales malignos). La BAI1 también se cree que funciona en la adhesión celular y transducción de señales en el cerebro. La secuencia Rac1 codifica una pequeña GTPasa llamada RAC1. La RAC1 actúa como un interruptor molecular en las vías de señalización que pueden cambiar la transducción de señales hacia dentro y fuera de una célula. La RAC1 está activo u "ON" cuando se une a una GTP e inactiva u "OFF" cuando se une con a un PIB. La forma inactiva de RAC1 (PIB-forma) se activa mediante el intercambio de GDP por GTP por los factores de cambio de nucleótidos de guanosina (GEFs). La inactivación de la RAC1 se consigue mediante la activación de las proteínas GTPasa (GAP), que revierten la conformación de nuevo a la forma inactiva unida a GDP a través de la hidrólisis del GTP.

c. ¿Cómo interactúan estas dos proteínas en una célula viva?
En una célula viva, después de la Rac 1

SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA DEL GEN HUMANO

SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA DEL GEN HUMANO

Objetivo

En esta práctica, leeremos secuencias de ADN obtenidos a partir de técnicas de secuenciación automáticas de ADN. Los datos se analizaron utilizando las bases de datos disponibles al público para identificar los genes y productos genéticos. 

Materiales

• Doce fragmentos de secuencias de ADN obtenidas automáticamente
• Ordenador 

Procedimiento

Ejercicio 1 

Ahora que está familiarizado con el proceso de inscripción y presentación de BLAST, lea el análisis de la secuencia de ADN de la copia impresa del gel (cualquier carril) y encuentre el gen que identifica esta huella. Para hacer esto:

 (1) Identificar la secuencia de nucleótidos (nucleótidos 100-200) a partir de la lectura de la secuencia de ADN. 

(2) Escriba al menos 70 bases en el cuadro de consulta del programa BLAST en la página web del NCBI. Las bases pueden ser de cualquier región de la secuencia, pero deben ser contiguas. 

(3) Examinar el informe de búsqueda BLASTN, identificar un gen probable, y examinar la identificación de genes para obtener información detallada.

SECUENCIA 1

-LÍNEA 1-





-LÍNEA 2-




-LÍNEA 3-





-LÍNEA 4-







SECUENCIA 2

-LÍNEA 1-





-LÍNEA 2-





-LÍNEA 3-




-LÍNEA 4-







SECUENCIA 3

-LÍNEA 1-





-LÍNEA 2-





-LÍNEA 3-





-LÍNEA 4-

Una vez que el gen ha sido identificado, responda a las siguientes preguntas:

1. ¿Cuál es el nombre de este gen?
El gen de la secuencia 1 es el  Ciclo de división celular 42 (proteína de unión a GTP) o CDC42 La CDC42 es una molécula reguladora intracelular clave que está implicada en la forma de la célula. En células de mamíferos, la proteína CDC42 regula el citoesqueleto de actina (el andamiaje de una célula) para producir una estructura filamentosa llamada filopodio, que están implicadas en la detección de otras células y el movimiento celular. Las mutaciones en CDC42 y sus proteínas asociadas se correlacionan con ciertos tipos de cáncer.

2. En comparación con la entrada GenBank, ¿qué cadena has leído?
He leído la primera secuencia

3. Al identificar una enfermedad causada por mutaciones en este gen. ¿Cuáles serían los motivos de un médico para realizar una búsqueda para esta enfermedad? ¿Y si quien realiza la búsqueda es una compañía de seguros? 

Diagnóstico para la discapacidad intelectual 

Secuencia de ADN 1

 Línea 1: GNNNNNTGGNNNNNNNATANTTGCGGCCGCGGTTTTNTTTTTTTNTTNNNCNNGGAGCACAANCNAATGNANTGTGTTGTTGTGGCGARGGCGARGGCGCCGTTHHTAAAACTGTCTCCTGATATCCTACACAACAAACAAATTTCAT

 Línea 2: CGGAGTATGTACCGACTGTTTTTGACAACTATGCAGTCACAGTTATGATTGGTGGAGAACCATATACTCTTGGACTTTTTGATACTGCAGGGCAAGTTATGACAGATTACGACCGCTCACTTATCCACAAACAG 

Línea 3: ATGTATTTCTAGTCTGTTTTTCAGTGGTCTCTCCATCTTCATTTGAAAACGTGAAAGAAAAGTGGTGCCTGAGATAACTCACCACTGTCCAAGACNCCTTTCTTGCTTGTTGGGACTCAAATTGATCTCAACGAGATGACCC

Línea 4: CTCTACTATTGAGAAACTTGCCAAGAACAAACAGAAGCCTATCACTCCANAGACTGGGTGAAAAGCTGGCCCGTGACCTGAANGCNGTCAAAGTATGTGGAGTGTTCTGCACTTACACAGCAGANGTCTGAAAAATGTGTTNATGAAGC

Secuencia 1: Ciclo de división celular 42 (proteína de unión a GTP) o CDC42 La CDC42 es una molécula reguladora intracelular clave que está implicada en la forma de la célula. En células de mamíferos, la proteína CDC42 regula el citoesqueleto de actina (el andamiaje de una célula) para producir una estructura filamentosa llamada filopodio, que están implicadas en la detección de otras células y el movimiento celular. Las mutaciones en CDC42 y sus proteínas asociadas se correlacionan con ciertos tipos de cáncer.

Secuencia de ADN 2

 Línea 1: TGCNNNNNTGGNTNNGGNNNNNATTGNNTCNCTNTACCATGCNNGNGCACAANGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGGCAAAGCGTACAAAGGTTCCAAGGGACAGGACCAAGAACGAGGGGCTGAGACATTTACAACAGCAGGCATT

 Línea 2: TTTCTCTTCCTCTTCTTCACGGGAGGCGGGCANAGGACTGCTCGGATCGCTTCGTCAAACACTGTCTTGAGGCCTCNCTGTGTGAGCGCCGAGCACTCCAGGTATTTTACAGCACCAATCTCCTTANCCATGGCTANAC

  Línea 3: CCCTGCGGATAGGTGATGGGAGTCAGCTTCTTCBCCTTCAGTTTCNCNATCGTGTCTTTATCATCCCTAAGATCAAGTTTAGTTCCCACTANGATGATGGGAGTGTTGGGACAGTGGTGCCGCACCTCAGGATACCACTT

  Línea 4: TGCACGGACATTTTCAAATGATGCAGGACTCACAAGGGAAAAGCAAATTAAGAACACATCTGTTTGCGGATAGGATAGGGGGCGTATTCTGTCATAATCTTCTTGTCCAGCTGTATCCCAAAAAGCCCAGATTCACCGGTTT

Secuencia 2: Ras relacionada con toxina botulínica C3 substrato 1 (familia rho, pequeña unión GTP de proteína Rac1) o RAC1 El gen RAC1 para una proteína reguladora que altera el citoesqueleto de actina para producir ondulaciones en la membrana, importantes para la motilidad celular. RAC1 es importante en un gran número de enfermedades, incluyendo el cáncer. Muchos tumores utilizarán la señalización RAC1 para conseguir un aumento de la motilidad y la capacidad invasiva, una de las primeras etapas requeridas para que el cáncer pueda propagarse por todo el cuerpo.

Secuencia de ADN 3 

Línea 1: TGNNNNNNTGNNNNNNNGNNANAACGAAGTGCAGACTCAAAAGTGCCATCTCCCTCCCGACCATTGGAGGATCCCAAGCTCTATGTTGCCCTTATTGTCACCAGTGACATTTAATTCCAAACAGGAGTCCTTCGGGCCAGCAA

Línea 2: GCTGCCCAGGCTTAGCTGCGAGCCCGTCATGGAGGAAAAAAGCTCAGGAGAAAACCAGTCTGTTGGAGAATGGGACAGTCCACCAGGGAGACACCTCGTGGGGCTCCAGCGGTTCTGCATCTCAGTCCAGCCAAGGCAGA 

Línea 3: GACAGCCACTCCTCCAGCCTGTCCGAACAGTACCCCGACTGGGCCAGCCGAGGACATGTTTGACCATCCCACCCCATGCGAGCTCATCAAGGGGAAAGACTAAGTCAGAGGAGTCCCTCTCTGACCTTACAGGTTCCCTCCCTCCTCTCC

Línea 4: CCTGCAAGCTTGATCTTGGGCCCTCACTTTTGGATGANGTGCTGAATGTTATGGATAAAAATAAGTAACTCGAGCATGCATCTAGAAGGGCCTATTCTATAATGTCACCTAAATGCTAAACCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCNT

Secuencia 3: proteína efectora CDC42 (Rho GTPasa vinculante) 3 o CDC42EP3 La CDC42 (secuencia 1) regula la formación de estructuras que contienen F-actina, mediante su interacción con diferentes proteínas efectoras. La CDC42EP3, una de estas proteínas efectoras, está implicada en la unión a la proteína CDC42, provocando cambios en la forma de una célula. Una célula detecta señales del ambiente externo mediante la creación de redes de moléculas de transmisión que indican a la célula cómo responder a dichas señales externas. Los defectos en estas moléculas de transmisión están implicados en muchas enfermedades, incluyendo cáncer.

SOUTHERN BLOT

SOUTHERN BLOT

Objetivo

El objetivo de la práctica es introducir el uso de la transferencia de southern como una herramienta para identificación genética en una hipotética determinación de la paternidad. 

Materiales

• Pipetas de transferencia 

• Pipetas graduadas y auxiliar de pipeteo

• Probeta de 100 mL

• Fuente de energía para electroforesis

• Cubeta para electroforesis 

• Molde para el gel de agarosa y peine 

• Bandeja de tinción 

• Baño de agua caliente 

• Incubador 

• Micropipetas automáticas y puntas 

• Microondas 

• Agitadora automática

• Membrana de nylon 7x7

Reactivos

• Agua destilada 

• NaCl y NaOH

• HCl concentrado 

• Muestras de ADN (ADN madre, hijo, padre 1 y padre 2 cortados con enzimas de restricción)

• Tampón de electroforesis

• Agarosa 

• Blot DNA Stain solution 10x

Introducción a la técnica de southern blot

Es una técnica de hibridación que permite identificar fragmento de ADN separados por electroforesis y transferidos a una membrana. 

El material de partida es ADN purificado, al cual se somete a una digestión con enzimas de restricción y a continuación a una electroforesis en gel. Después de la electroforesis se transfiere el ADN a una membrana para obtener una técnica exacta del patrón de bandas que hay en el gel de agarosa. 

La hibridación de la membrana se realiza incubándola con diferentes reactivos en un tubo de hibridación junto a la sonda y diluidas en una solución de hibridación adecuada. 

El revelado se realiza mediante una autorradiografía con una película de rayos x, de manera que aparecerá una mancha oscura en los puntos de la membrana donde se localicen los híbridos sonda/secuencia diana. 

Descripción de la práctica 

Para esta práctica se obtuvieron 2 ADN de 2 posibles padres, los cuales fueron digeridos con la misma enzima de restricción pero en reacciones separadas. El objetivo es determinar quién es el padre del hijo mediante el análisis y emparejar el patrón de fragmentación del ADN después de la electroforesis en el gel de agarosa. 

Precauciones

- Siempre debemos llevar puestos los EPIs

- No pipetear con la boca 

- Debemos tener mucha precaución cuando trabajemos con los equipos y reactivos que desprenden mucho calor.

- Lavarse las manos con agua y jabón antes y después de trabajar

Preparaciones previas

• Preparaciones para las soluciones de transferencia

- Preparar 1L de HCl 0,25N: Para ello mezclamos 21 mL de HCl concentrado 12N y 979 mL de agua destilada

-Preparamos 2L de la solución de desnaturalización ADN alcalina/salina 0,5 NaOH y 0,6 NaCl. Añadimos el NaOH y NaCl al agua, utilizando un agitador magnético para disolverlos. Añadimos agua hasta 2L. 

Para ello mezclamos 1,8 L de agua destilada, 40 gramos de NaOH pellets y 70 gramos de NaCl.

• Preparación de la solución de tinción

-El día que las membranas deban ser teñidas para su visualización preparamos la solución de tinción Blue-Blot DNA stain por mezcla como se indica. Mezclamos 540 mL de agua destilada y 60 mL de blue-blot DNA satain 10x.

Procedimiento de la práctica

1. Electroforesis en gel de agarosa

- Preparación del gel de agarosa 

Utilizaremos una agarosa de un 0,8% en un molde de 7x7. Debe haber 6 pocillos de 40 microlitros cada uno. 

Para preparar el gel, pesamos la agarosa en la balanza analítica. Necesitamos 0,35 gramos de agarosa en polvo. 

Cuando tengamos la agarosa, realizamos el tampón TBE mezclando 900mL de TBE 10x y 100 mL de agua destilada. 

Cuando tengamos el tampón lo echamos en un matraz aforado y a este le añadimos la agarosa, mezclamos y tapamos con parafilm. Esta mezcla la calentamos en el microondas durante 4 minutos y la dejamos reposar para que la Tª baje hasta 55ºC. 

En el momento que la mezcla de tampón y agarosa esté en los 55ºC aproximadamente, la echamos en el molde y ponemos los pocillos. Por último dejamos enfriar.

**Debemos tener cuidado de que no hallan ni pelos ni burbujas.

-Electroforesis

Cuando el gel ya este frío, lo desmoldamos; a la vez vamos preparando la cubeta de electroforesis a la que le debemos añadir tampón TBE.

Mientras nosotros preparamos la cubeta, otro grupo se encarga de descongelar las muestras en el baño maría. 

Cuando tengamos la cubeta, introducimos el gel dentro y procuramos que el tampón lo cubra y que los pocillos estén en el polo negativo (las muestras correrán del lado negativo al positivo). 

Una vez lo tengamos todo, pipeteamos las muestras en los pocillos con mucho cuidado para que no se rompa el gel, ni que se nos salga la muestra del pocillo. 

En esta parte tuvimos muchos problemas, porque se nos salía la muestra del pocillo. Nos dimos cuenta que el pocillo era pequeño y solo se quedaba una parte de la muestra. 

Cuando terminamos de cargar las muestras, le ponemos la tapa a la cubeta y la enchufamos a la fuente de energía. Programamos 150 voltios durante 55 minutos. 

Cuando pasó el tiempo, podíamos observar que la poca muestra que había en el pocillo se había corrido. 

2.Análisis del southern blot 

Cuando tengamos el gel de agarosa, lo colocamos en una cubeta de 100 mL de HCl 0,25N y lo dejamos incubar a Tª ambiente y en la agitadora automática.

Cuando terminemos eliminamos la solución , ya que no se podrá volver a utilizar, y lavamos el gel con agua destilada varias veces. 

Colocamos el gel en otra cubeta que contiene solución desnaturalizante durante 15 minutos, mientras está en la agitadora automática. 

Después tiramos esa solución y volvemos a llenar otra cubeta con la misma solución durante otros 15 minutos y dejamos reposar.

En el momento que el gel ya este, colocamos unas hojas de papel en una superficie plana. 

En nuestro caso utilizamos una cubeta de tinción, ya que son muy grandes. 

Dentro de la cubeta pusimos un molde grande de electroforesis y encima de ella papel de filtro. 

Cogemos la membrana de nylon con ayuda de dos pinzas y la introducimos en una cubeta que contiene solución desnaturalizante. La dejamos hidratándose un par de minutos y la sacamos de las puntas con ayuda de las pinzas. 

Después colocamos el gel sobre el papel de filtro con los pocillos hacia abajo y encima la membran de nylon. 

Colocamos un monton de papel absorbente encima de la membrana y encima unos pesos (placa de cristal y varios pesos de centrífuga). Esta estructura la dejamos un fin de semana entero.

Cuando paso el fin de semana, quitamos el papel absorbente y los pesos y con ayuda de unas pinzas quitamos la membrana de nylon y la dejamos sobre papel de filtro.

Con ayuda de un rotulador, marcamos donde están los seis pocillos en la membrana; y después utilizamos una pinzas para quitar el gel de la membrana. 

Para unos resultados óptimos introduciremos la membrana en un horno a 80ºC durante 30 minutos.

3.Detección no isotópica del ADN

Colocamos la membrana en una cubeta que contiene 100mL de la solución blue-blot stain durante 10-15 minutos. 

Sacamos la membrana y la colocamos en una cubeta con agua destilada para lavarla.

Cambiamos el agua destilada dos o tres veces hasta que la membrana esté desteñida por completo.

Al final solo se veía una banda muy pequeña y no se podía distinguir nada muy bien.