SOUTHERN BLOT

SOUTHERN BLOT

Objetivo

El objetivo de la práctica es introducir el uso de la transferencia de southern como una herramienta para identificación genética en una hipotética determinación de la paternidad. 

Materiales

• Pipetas de transferencia 

• Pipetas graduadas y auxiliar de pipeteo

• Probeta de 100 mL

• Fuente de energía para electroforesis

• Cubeta para electroforesis 

• Molde para el gel de agarosa y peine 

• Bandeja de tinción 

• Baño de agua caliente 

• Incubador 

• Micropipetas automáticas y puntas 

• Microondas 

• Agitadora automática

• Membrana de nylon 7x7

Reactivos

• Agua destilada 

• NaCl y NaOH

• HCl concentrado 

• Muestras de ADN (ADN madre, hijo, padre 1 y padre 2 cortados con enzimas de restricción)

• Tampón de electroforesis

• Agarosa 

• Blot DNA Stain solution 10x

Introducción a la técnica de southern blot

Es una técnica de hibridación que permite identificar fragmento de ADN separados por electroforesis y transferidos a una membrana. 

El material de partida es ADN purificado, al cual se somete a una digestión con enzimas de restricción y a continuación a una electroforesis en gel. Después de la electroforesis se transfiere el ADN a una membrana para obtener una técnica exacta del patrón de bandas que hay en el gel de agarosa. 

La hibridación de la membrana se realiza incubándola con diferentes reactivos en un tubo de hibridación junto a la sonda y diluidas en una solución de hibridación adecuada. 

El revelado se realiza mediante una autorradiografía con una película de rayos x, de manera que aparecerá una mancha oscura en los puntos de la membrana donde se localicen los híbridos sonda/secuencia diana. 

Descripción de la práctica 

Para esta práctica se obtuvieron 2 ADN de 2 posibles padres, los cuales fueron digeridos con la misma enzima de restricción pero en reacciones separadas. El objetivo es determinar quién es el padre del hijo mediante el análisis y emparejar el patrón de fragmentación del ADN después de la electroforesis en el gel de agarosa. 

Precauciones

- Siempre debemos llevar puestos los EPIs

- No pipetear con la boca 

- Debemos tener mucha precaución cuando trabajemos con los equipos y reactivos que desprenden mucho calor.

- Lavarse las manos con agua y jabón antes y después de trabajar

Preparaciones previas

• Preparaciones para las soluciones de transferencia

- Preparar 1L de HCl 0,25N: Para ello mezclamos 21 mL de HCl concentrado 12N y 979 mL de agua destilada

-Preparamos 2L de la solución de desnaturalización ADN alcalina/salina 0,5 NaOH y 0,6 NaCl. Añadimos el NaOH y NaCl al agua, utilizando un agitador magnético para disolverlos. Añadimos agua hasta 2L. 

Para ello mezclamos 1,8 L de agua destilada, 40 gramos de NaOH pellets y 70 gramos de NaCl.

• Preparación de la solución de tinción

-El día que las membranas deban ser teñidas para su visualización preparamos la solución de tinción Blue-Blot DNA stain por mezcla como se indica. Mezclamos 540 mL de agua destilada y 60 mL de blue-blot DNA satain 10x.

Procedimiento de la práctica

1. Electroforesis en gel de agarosa

- Preparación del gel de agarosa 

Utilizaremos una agarosa de un 0,8% en un molde de 7x7. Debe haber 6 pocillos de 40 microlitros cada uno. 

Para preparar el gel, pesamos la agarosa en la balanza analítica. Necesitamos 0,35 gramos de agarosa en polvo. 

Cuando tengamos la agarosa, realizamos el tampón TBE mezclando 900mL de TBE 10x y 100 mL de agua destilada. 

Cuando tengamos el tampón lo echamos en un matraz aforado y a este le añadimos la agarosa, mezclamos y tapamos con parafilm. Esta mezcla la calentamos en el microondas durante 4 minutos y la dejamos reposar para que la Tª baje hasta 55ºC. 

En el momento que la mezcla de tampón y agarosa esté en los 55ºC aproximadamente, la echamos en el molde y ponemos los pocillos. Por último dejamos enfriar.

**Debemos tener cuidado de que no hallan ni pelos ni burbujas.

-Electroforesis

Cuando el gel ya este frío, lo desmoldamos; a la vez vamos preparando la cubeta de electroforesis a la que le debemos añadir tampón TBE.

Mientras nosotros preparamos la cubeta, otro grupo se encarga de descongelar las muestras en el baño maría. 

Cuando tengamos la cubeta, introducimos el gel dentro y procuramos que el tampón lo cubra y que los pocillos estén en el polo negativo (las muestras correrán del lado negativo al positivo). 

Una vez lo tengamos todo, pipeteamos las muestras en los pocillos con mucho cuidado para que no se rompa el gel, ni que se nos salga la muestra del pocillo. 

En esta parte tuvimos muchos problemas, porque se nos salía la muestra del pocillo. Nos dimos cuenta que el pocillo era pequeño y solo se quedaba una parte de la muestra. 

Cuando terminamos de cargar las muestras, le ponemos la tapa a la cubeta y la enchufamos a la fuente de energía. Programamos 150 voltios durante 55 minutos. 

Cuando pasó el tiempo, podíamos observar que la poca muestra que había en el pocillo se había corrido. 

2.Análisis del southern blot 

Cuando tengamos el gel de agarosa, lo colocamos en una cubeta de 100 mL de HCl 0,25N y lo dejamos incubar a Tª ambiente y en la agitadora automática.

Cuando terminemos eliminamos la solución , ya que no se podrá volver a utilizar, y lavamos el gel con agua destilada varias veces. 

Colocamos el gel en otra cubeta que contiene solución desnaturalizante durante 15 minutos, mientras está en la agitadora automática. 

Después tiramos esa solución y volvemos a llenar otra cubeta con la misma solución durante otros 15 minutos y dejamos reposar.

En el momento que el gel ya este, colocamos unas hojas de papel en una superficie plana. 

En nuestro caso utilizamos una cubeta de tinción, ya que son muy grandes. 

Dentro de la cubeta pusimos un molde grande de electroforesis y encima de ella papel de filtro. 

Cogemos la membrana de nylon con ayuda de dos pinzas y la introducimos en una cubeta que contiene solución desnaturalizante. La dejamos hidratándose un par de minutos y la sacamos de las puntas con ayuda de las pinzas. 

Después colocamos el gel sobre el papel de filtro con los pocillos hacia abajo y encima la membran de nylon. 

Colocamos un monton de papel absorbente encima de la membrana y encima unos pesos (placa de cristal y varios pesos de centrífuga). Esta estructura la dejamos un fin de semana entero.

Cuando paso el fin de semana, quitamos el papel absorbente y los pesos y con ayuda de unas pinzas quitamos la membrana de nylon y la dejamos sobre papel de filtro.

Con ayuda de un rotulador, marcamos donde están los seis pocillos en la membrana; y después utilizamos una pinzas para quitar el gel de la membrana. 

Para unos resultados óptimos introduciremos la membrana en un horno a 80ºC durante 30 minutos.

3.Detección no isotópica del ADN

Colocamos la membrana en una cubeta que contiene 100mL de la solución blue-blot stain durante 10-15 minutos. 

Sacamos la membrana y la colocamos en una cubeta con agua destilada para lavarla.

Cambiamos el agua destilada dos o tres veces hasta que la membrana esté desteñida por completo.

Al final solo se veía una banda muy pequeña y no se podía distinguir nada muy bien.