DETERMINACIÓN DEL FACTOR Rh POR PCR
El objetivo de este experimento es la determinación del Rh utilizando para ello técnicas de la PCR y de la electroforesis de ADN. Para ello, nosotros asilaremos el ADN de nuestra saliva y lo utilizaremos para llevar a cabo la reacción de PCR. La base de la práctica es la amplificación de un fragmento del gen D. La amplificación de este fragmento indicará que la persona es Rh+.
Debido a que los genes D y CE son altamente homólogos, es posibles diseñar cebadores que se emparejan en una región del gen D y también en una región del gen CE. De esta forma, los individuos Rh+ producirán 2 fragmentos de diferentes tamaños (1200 pb y 600 pb) correspondientes a los genes D y CE, mientras que los individuos Rh- producirán unúnico fragmento (1200 pb) correspondientes al gen CE.
-DESARROLLO DE LA PRÁCTICA
- EXTRACCIÓN DE ADN
Lo primero que debemos hacer es extaer una muestra de ADN bucal a partir de nuestra saliva. Nosotros hicimos esa práctica en el primer trimestre y congelamos las muestras hasta marzo, que el mes en que empezamos la PCR.
- AMPLIFICACIÓN POR PCR
- Mix PCR, es una master mix que ya contiene previamente mezclados todos los componentes de la PCR, conexcepción del ADN molde. También incluye el tampón de carga.
- Control positivo
- Agua destilada
- EPIS
- Termociclador
- Tubos de 0,2 mL
- Micropipetas y puntas
- Gradillas para los tubos de 0,2 mL
- Marcamos los tubos con las iniciales de cada miembro del grupo, solo habrá cuatro muestras de ADN por grupo. Marcamos dos tubos más, uno como C+ (control positivo) y otro como C- (control negativo).
- En el tubo C- ponemos 22,5 microlitos de mix PCR y 2,5 microlitros de agua destilada.
- En el tubo C+ ponemos 22,5 microlitros de mix PCR y 2.5 microlitros de control positivo.
- En cada tubo de muestras marcado con las iniciales de los miembros del grupo, dipensamos 22,5 microlitros de mix PCR y 2.5 microlitros de ADN correspondiente a cada miembro del grupo. Mezclamos bien
Además tampoco hicimos control positivo ni negativo, ya que tres grupos anteriores lo habían hecho y había de sobra para todos, ya que en cada pocillo solo caben 5 microlitos.
Después de todo esto, metimos los tubos en el termociclador, que ya estaba programado a :
- 10 minutos 95ºC
-35 ciclos : 1 minuto a 95ºC, 1 minutos a 64ºC y 1 minuto a 72ºC.
- ELECTROFORESIS E INTERPRETACIÓN
- MATERIALES Y REACTIVOS
- Tampón TBE o TAE
- Marcador Pm (escalera de ADN)
- Control + y -
- Agua destilada
- Muestras de ADN
- Colorante
- Cubeta de electroforesis
- Fuente de alimentación
- Transiluminador
- Documentador de geles
- Tubos de 0,2 mL
- Gradilla para los tubos de 0,2 mL
- Vaso de precipitados
- Probeta de 1000 mL
- Pipetas graduadas
- Micropipetas y puntas
- Preparación del gel, cargar de los pocillos y comienzo de la electroforesis
Lo primero que vamos a hacer es limpiar nuestros puestos de trabajo, ya que hay que trabajar con la técnica aséptica. Depués preparamos todos los materiales.
-Lo primero es sacar el gel de agarosa del frigo y desmoldarlo con mucho cuidado, porque se nos puede romper.
- Preparamos el tampón TAE 1X , ya que hemos hecho el gel al 1%. Como en el laboratorio teníamos tampón TAE al 10x ( que contiene tris, acetato y EDTA), hemos cogido una probeta de 1000 mL y hemos puesto 100 mL de tampón TAE y 900 mL de agua destilada. Una vez preparado lo hemos repartido entre todos los grupos.
-Para preparar la cubeta de electroforesis, primero hemos medido con agua destilada el volumen que le entrará a la cubeta de tampón TAE.
-Hemos echado el tampón en un vaso de precipitados de 250 mL y luego unos 100 mL más, lo suficiente para cubrir la cubeta y el gel.
-A continuación hemos metido el gel con el soporte
- Descongelamos la escalera de Beethoven en el baño termostatizado
-Después sacamos las muestras del termociclador y preparamos las micropipetas y las puntas para cargar los pocillos. Cogemos una micropipeta fija de 5 microlitos ( el volumen que se cogerá para cada pocillo) y lo primero que cogemos es el control + y lo echamos en el primer pocillo, después echamos la primera muestra de ADN y a continuación las dos siguientes, después el control - y por último la escalera de beethoven. Hay que tener mucho cuidado porque los pocillos son muy frágiles y no se pueden tocar, para eso hay que tener una buena técnica de pipeteo.
-Una vez los pocillos cargados, cerramos la cubeta y la enchufamos a la fuente de alimentación. Programamos la fuente a 150 voltios durante 30 minutos.
- Preparación del colorante blue bloots
- Teñido del gel de agarosa
Hemos recogido el gel con unos plásticos que hemos recortado para poder separarlos del soporte, y lo hemos depositado en la cubeta de plástico que contenía el colorante y lo hemos dejado teñir durante 10 minutos.
Después de los 10 minutos, lo hemos sacado con la ayuda de los plástico con los que los introdujimos, y lo hemos lavado con agua destilada. En el momento de lavarlo se ha caído un trozo, pero no ha pasado nada grave, porque las muestras habían corrido a través del gel.
- Observación del gel e interpretación de los resultados
Lo hemos unido como hemos podido y lo hemos observado al transiluminador, pero no hemos visto gran cosa. Como no veíamos mucho, lo hemos metido en el documentador de geles y le hemos echado unas fotos, pero tampoco se veía mucho mas.
Cuando lo hemos sacado, se nos ha terminado de romper, porque el gel era ya demasiado frágil.
Como solo ha quedado un trozo pequeño, lo hemos puesto al trasluz y hemos podido ver como se han corrido las muestras y la escalera.
Así que aunque se nos haya roto hemos podido ver nuestras muestras, pero claro no hemos podido interpretar los resultados.
Al trasluz se veía así:
