TINCIÓN DE CROMOSOMAS DE CÉLULAS CANCERÍGENAS PREFIJADAS
El objetivo de esta práctica es es utilizar la tinción de giemsa para examinar el cariotipo de células cancerígenas. En este experimento las células han sido prefijadas en portaobjetos en metafase permitiéndonos teñir y observar los cromosomas condensados.
- MATERIALES Y EQUIPOS
- Cubreobjetos
- Microtubos
- Micropipetas
- Microscopio
- Vasos de precipitados
- Papel absorbente
- EPIS
- REACTIVOS
- Agua destilada
- Medio de montaje
- Tinción giemsa
- Portaobjetos con células fijadas
Por tanto, estas células presentan un
cariotipo anormal, el cromosoma Philadelphia, una segunda translocación entre el
cromosoma 15 y 17, y un total de 68 cromosomas.
Para realizar un cariotipo, as células son cultivadas por un periodo breve de
tiempo en el laboratorio y luego son tratadas con colchicina que inhibe la formación de
microtubos y la división celular es detenida en la metafase.
Estas células son fijadas al porta y después se realiza la tinción con giemsa, que tiñe el ADN permitiendo visulizar los cromosomas al microscopio.
No debemos olvidar que para realizar cualquier tipo de práctica debemos tener sumo cuidado y trabajar con los EPIS y la técnica aséptica. Hay que evitar cualquier tipo de contaminación y hay que lavarse las manos con jabón antes de empezar y después de finalizar la práctica.
- PROCEDIMIENTO DE LA PRÁCTICA
Utilizamos un microscopio de campo claro, primero utilizamos un objetivo de 10x o 20x. Depués de visualizar la metafase, utilizamos el aceite de inmersión.
Movemos el campo de visión y contamos el número de cromosomas e identificamos la región del centrómero.
Nosotros pudimos observar algunos cromosomas que se tiñieron, pero eran tan pequeños que no pudimos diferenciar sus partes.
-Cuestiones
1. ¿Cuál es el número normal de cromosomas en las células humanas?¿Son las células normales haploides o diploides?
46 cromosomas diploides (n=23)
2. ¿Cómo funciona la colchicina en las células y por qué es útil en la metafase?
La colchicina se une a la tubulina e inhibe la formación de los microtúbulos, los cuales son los responsables de la separación de las cromátidas hermanas durante la mitosis. Por tanto, la colchicina detiene la progresión del ciclo celular en la metafase. En este momentos los cromosomas están más condensados y el núcleo ha sido degradado permitiendo la fácil visualización de los cromosomas.
3. ¿Por qué sólo algunas células muestran los cromosomas mientras otras mantienen el núcleo intacto?
El ciclo celular de las células tiene un tiempo aproximado de 24 horas, y el tratamiento de la colchicina sólo puede durar algunas horas antes de convertirse tóxico para las células. Por tanto, sólo una proporción de células se pararán en la metafase cuando sean fijadas en el portaobjetos. Estas células mostrarán los cromosomas y las otras se encontrarán en otros estados del ciclo celular y el núcleo intacto.
4. ¿Por qué crees que hay anomalías cromosómicas severas o letales, mientras que otras anomalías son relativamente suaves?
Algunas anomalías autosómicas incluyendo delecciones o duplicaciones conducen a una concentración no adecuada del producto de los genes. Las células requieren una expresión específica de los niveles de sus proteínas y los cambios en los cromosomas pueden llevar a una alteración en la expresión génica. En el caso de la trisomía del 21 (Síndrome de Down), el incremento de los niveles de proteínas producido por un cromosoma extra es relativamente bien tolerado mientras que otros cambios en otros cromosomas autosómicos son letales. Las delecciones o duplicaciones del cromosoma X conduce a producir sólo algunos efectos negativos ya que sólo existe un cromosoma X activo, debido a esto, un cromosoma X extra es inactivado.
5. ¿Por qué una trasnlocación balanceada entre 2 cromosomas conduce a individuos sanos?
En una translocación balanceada, partes de un cromosoma es intercambiada pero el material genético no se pierde o duplicado. Frecuentemente, el resultado son individuos sanos sin negativos efectos aunque ciertas translocaciones pueden producir una expresión e los genes baja o aumentada produciendo esto una enfermedad.
Estas células son fijadas al porta y después se realiza la tinción con giemsa, que tiñe el ADN permitiendo visulizar los cromosomas al microscopio.
No debemos olvidar que para realizar cualquier tipo de práctica debemos tener sumo cuidado y trabajar con los EPIS y la técnica aséptica. Hay que evitar cualquier tipo de contaminación y hay que lavarse las manos con jabón antes de empezar y después de finalizar la práctica.
- PROCEDIMIENTO DE LA PRÁCTICA
- Marcamos 12 microtubos, 6 con la palabra giemsa y 6 tubos con medio de montaje.
- Para preparar el giemsa, añadimos 7 mL de agua destilada con una pipeta graduada al bote de giemsa y mezclamos por inversión.
- Dispensamos 1 mL de de cada reactivo en cada microtubo . Para los microtubos que están marcados como medio de montaje no pudimos echar 1 mL para cada uno porque no había suficiente, pero tampoco hacía falta ya que solo necesitábamos un par de gotas por cada portaobjetos
- Preparamos un vaso de precipitados para lavar el porta. Si lo hemos lavado una vez y no se ha ido del todo el colorante, tiramos el agua del vaso de precipitados y echamos nueva para poder lavarlo de nuevo.
- Distribuimos las preparaciones para cada grupo, 1 porta, 2 micropipetas y 1 vaso con agua destilada por grupo.
-Tinción con giemsa
- Añadimos 250 microlitros de la tinción giemsa en el área del porta que contiene la extensión de células en metafase. Cuando se lo terminemos de añadir agitamos muy suavemente en forma de círculos para que el giemsa se extienda bien .
- Lo dejamos incubar durante 15 minutos a Tª ambiente.
- Eliminamos la tinción sobrante aspirando con la micropipeta y sumergimos cuidadosamente la preparación en el vaso de precipitados que contiene agua destilada durante 30 segundos. Si no se lava bien, tiramos el agua destilada y volvemos a rellenar el vaso de nuevo, después volvemos a meter el porta hasta que esté bien lavado.
- Lo dejamos secar a Tª ambiente durante 5-10 minutos. Para eliminar todo el agua inclinamos el porta para recoger el agua en un extremo y nos podemos ayudar con la punta de un papel secante. No podemos tocar el círculo que contiene las células, ya que podemos eliminarlas.
- Utilizando la otra micropipeta añadimos 1 o 2 gotas de medio de montaje a las células teñidas.
- Por último debemos colocar un cubreobjetos sobre el círculo que contiene a las células, debemos tener cuidado para que no se formen burbujas.
-Observación al microscopio
Utilizamos un microscopio de campo claro, primero utilizamos un objetivo de 10x o 20x. Depués de visualizar la metafase, utilizamos el aceite de inmersión.
Movemos el campo de visión y contamos el número de cromosomas e identificamos la región del centrómero.
Nosotros pudimos observar algunos cromosomas que se tiñieron, pero eran tan pequeños que no pudimos diferenciar sus partes.
-Cuestiones
1. ¿Cuál es el número normal de cromosomas en las células humanas?¿Son las células normales haploides o diploides?
46 cromosomas diploides (n=23)
2. ¿Cómo funciona la colchicina en las células y por qué es útil en la metafase?
La colchicina se une a la tubulina e inhibe la formación de los microtúbulos, los cuales son los responsables de la separación de las cromátidas hermanas durante la mitosis. Por tanto, la colchicina detiene la progresión del ciclo celular en la metafase. En este momentos los cromosomas están más condensados y el núcleo ha sido degradado permitiendo la fácil visualización de los cromosomas.
3. ¿Por qué sólo algunas células muestran los cromosomas mientras otras mantienen el núcleo intacto?
El ciclo celular de las células tiene un tiempo aproximado de 24 horas, y el tratamiento de la colchicina sólo puede durar algunas horas antes de convertirse tóxico para las células. Por tanto, sólo una proporción de células se pararán en la metafase cuando sean fijadas en el portaobjetos. Estas células mostrarán los cromosomas y las otras se encontrarán en otros estados del ciclo celular y el núcleo intacto.
4. ¿Por qué crees que hay anomalías cromosómicas severas o letales, mientras que otras anomalías son relativamente suaves?
Algunas anomalías autosómicas incluyendo delecciones o duplicaciones conducen a una concentración no adecuada del producto de los genes. Las células requieren una expresión específica de los niveles de sus proteínas y los cambios en los cromosomas pueden llevar a una alteración en la expresión génica. En el caso de la trisomía del 21 (Síndrome de Down), el incremento de los niveles de proteínas producido por un cromosoma extra es relativamente bien tolerado mientras que otros cambios en otros cromosomas autosómicos son letales. Las delecciones o duplicaciones del cromosoma X conduce a producir sólo algunos efectos negativos ya que sólo existe un cromosoma X activo, debido a esto, un cromosoma X extra es inactivado.
5. ¿Por qué una trasnlocación balanceada entre 2 cromosomas conduce a individuos sanos?
En una translocación balanceada, partes de un cromosoma es intercambiada pero el material genético no se pierde o duplicado. Frecuentemente, el resultado son individuos sanos sin negativos efectos aunque ciertas translocaciones pueden producir una expresión e los genes baja o aumentada produciendo esto una enfermedad.
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