CARIOTIPO EN SANGRE PERIFÉRICA
El cariotipo es el conjunto de cromosomas, con sus características, número y forma propios de cada especie. Los cromosomas humanos son estructuras organizadas que están en el núcleo de las células y que contienen la información genética del individuo. Están compuestos por ADN e histonas, y adquieren esa forma durante el proceso de división celular o mitosis, en la fase donde ocurre la máxima condensación del ADN, en la metafase.
En la especie humana el número normal de cromosomas es de 46, de los cuales 44 son autosomas y 2 son cromosomas sexuales, XX en mujeres y XY en hombres.
Las anomalías en el número de cromosomas, como las trisomías y las monosomías, son responsables del síndrome de Down (trisomía 21), síndrome de Klinefelter (47, XXY),...
Las anomalías es la estructura de los cromosomas pueden producir el síndrome de maullido de gato (delección en el 5p), translocaciones recípriocas, robertsonianas,...
2. INVENTARIO DE MATERIAL
- Muestras de sangre fresca en heparina
- KCl (Cloruro potásico)
- Ácido acético glaciar
- Metanol
- Pastillas de buffer pH 6.8
- Fitohemaglutinina
- Suero fisiológico
- Giemsa
- Colchicina
- Tripsina
- Agua destilada
- Medio de cultivo enriquecido
- Pipetas pasteur de 3mL (rotular como A, B y C)
- Bote de 100 mL
3. PREPARACIÓN DE REACTIVOS
En esta práctica haremos dos tubos por cada grupo, así que prepararemos dos tubos de cultivo con sangre y haremos 4 portas distintos. A cada tubo los nombraremos tubo A y tubo B, y llevaran el nombre del grupo G2.
- SOLUCIÓN DE KCl
Para preparar 100 mL:
- Pesamos 0,56g de KCl
- Añadimos 100 mL de agua destilada
- Disolvemos
- FIJADOR CARNOY
Usaremos 50 mL de ácido acético glaciar y 150 mL de metanol. El ácido acético glaciar está congelado y debemos meterlo en el baño termostatizado a 37ºC unos 20 minutos.
Lo almacenaremos a temperatura ambiente.
** A la hora de manipular el ácido acético y el metanol, se debe evitar su inhalación y en la medida de lo posible, trabajar en campana o en una zona muy bien ventilada; nosotros trabajaremos con la campana de extracción de gases.
No nos podemos olvidar, que a la hora de trabajar el metanol debemos usar siempre guantes ( si es doble, mejor) y evitar el contacto con la piel.
- BUFFER pH 6.8
Diluimos una pastilla de buffer en 1 L de agua destilada. Lo almacenaremos a temperatura ambiente.
- TRIPSINA
Usaremos 1 mL de tripsina, 40 mL de suero fisiológico y 40 mL de buffer pH 6.8. Almacenaremos la tripsina a 4ºC, no más de 15 días.
- GIEMSA
Necesitaremos 10 mL de colorante giemsa y 90 mL de buffer pH 6.8. Lo almacenaremos a Tª ambiente.
4. PROTOCOLO DEL CARIOTIPO
Para realizar esta práctica ( y todas) tendremos que seguir la técnica aséptica, es decir, utilizar siempre los EPIS y desinfectar nuestra zona de trabajo para evitar la contaminación. Utilizaremos siempre papel de filtro para nuestros puestos de trabajo, materiales estériles y cabinas de flujo laminar.
4.1 Siembra de sangre periférica
Cada grupo descongelará un tubo de medio de cultivo y lo identificará con el nombre del grupo, en este caso G2. La descongelación se realizará en el baño termostatizado a 37ºC.
El medio de cultivo consiste en un medio enriquecido óptimo para el crecimiento celular.
Antes de todo tenemos que realizar la extracción de sangre. En clase, el profesor le extrajo sangre a una de las alumnas y la introdujo en un tubo con heparina. También hubo algunos alumnos que se pincharon con lancetas y recogieron la sangre con un capilar heparinizado.
- Cuando el tubo esté descongelado, añadimos con una micropipeta:
- 0,25 mL (250 microlitros) de fitohemaglutinina, esta sustancia impide que los linfocitos T se diferencien y queden inmaduros, esto hace que sea posible que se estén multiplicando continuamente. Si se diferencian, no se podrán multiplicar mas.
- 0,4 mL (400 microlitros) de sangre completa, agitando antes de pipetear la sangre.
- Después se agita el tubo para mezclar y se mantiene en la estufa a 37ºC durante 72 horas.
4.2 Sacrificio de sangre
** No olvidemos que son dos tubos, así que todos los volúmenes estarán multiplicados por 2.
- Añadimos con la micropipeta en el tubo de siembra de Colchicina, es una sustancia que hace que desaparezca el huso acromático. Antes de añadirla la descongelamos en el baño a 37ºC. Después agitamos suavemente y las dejamos en la estufa a 37ºC durante 45 minutos.
- A continuación centrifugamos durante 5 minutos a 1000 r.p.m. Cuando terminemos, eliminamos el sobrenadante con la pipeta pasteur de tranajo (A) y echamos el desecho en el bote de residuos.
** La pipeta B, es la pipeta para rellenar
** La pipeta C, es la pipeta limpia
4.3 Choque hipotónico
- Lo primero que hacemos es añadir con la pipeta B 5 mL de KCl al tubo, provocando que se produzca la lisis celular de los eritrocitos y que los linfocitos se hinchen. Para ello se deben seguir los siguientes pasos:
- Luego vamos añadimos los otro 4 mL despacio con la pipeta B, a la vez que se va pipeteando con la pipeta A, para que se mezcle bien.
** Un exceso de tiempo puede provocar que los cromosomas se dispersen y las metafases aparezcan incompletas y mezcladas entre ellas. NO nos podemos DETENER es este punto para evitar la lisis celular.
-Centrifugamos el tubo 5 minutos a 1000 r.p.m. Cuando termine, eliminamos el sobrenadante con la pipeta A y echamos el desecho en el bote de residuos dejando aproximadamente 0,5 mL en el tubo. Tenemos que evitar quitar el botón de precipitación cuando se retira el sobrenadante.
-Centrifugamos el tubo 5 minutos a 1000 r.p.m. Cuando termine, eliminamos el sobrenadante con la pipeta A y echamos el desecho en el bote de residuos dejando aproximadamente 0,5 mL en el tubo. Tenemos que evitar quitar el botón de precipitación cuando se retira el sobrenadante.
-Añadimos con la pipeta pasteur C 1 mL de fijador . El fijador es una solución carnoy que consiste en 3 partes de metanol y 1 parte de ácido acético. Esta solución se debe resuspender bien con la pipeta A muy despacio. Luego añadir con la pipeta C poco a poco 4 mL de fijador, y resuspendemos con la A.
- Centrifugamos 5 minutos a 1000 r.p.m.
**Se repiten los pasos 7 y 8 del fijador dos o tres veces en total, o hasta que el precipitado esté bien
limpio y blanco. El sobrenadante debe quedar prácticamente transparente.
Para el tubo A, lo limpiamos y centrifugamos 5 veces en total.
Para el tubo B, lo limpiamos y centrifugamos 3 veces en total.
-Quitamos el sobrenadante con la pipeta A dejando aproximadamente 0,5 mL. Resuspendemos bien con la pipeta A.
-Hacemos las extensiones en portaobjetos limpios, que previamente han estado en un frasco con agua fría metidos en la nevera. Antes de hacer la extensiones etiquetamos cada porta con el nombre del grupo y el tubo al que pertenecen las muestras.
Echamos 4-5 gotas a una distancia de 5-10 cm, para que los linfocitos se rompan al impactar sobre el vidrio, liberando así el material cromosómico. Las gotas las echamos en el centro del porta y las dejamos resbalar inclinando el porta para que se extienda por toda la superficie.
Al porta A1 le echamos las gotas desde 20 cm de altura y al A2 desde 10 cm de altura.
Al porta B1 le echamos las gotas desde 20 cm de altura y al B2 desde 10 cm de altura.
4.4. Bandeo y tinción de los cromosomas
-Lo primero que tuvimos que hacer fue preparar la solución de bandeo mezclando el microtubo de tripsina con el buffer. También preparamos la solución de tampón pH 6.8 y la solución de giemsa.
Echamos las tres soluciones en tres vasos de precipitados y al lado pusimos tres cubetas con varias paralelas para después lavar los portas.
- Primero, con ayuda de una pinzas de madera agarramos los portas y los sumergimos de dos en dos en el primer vaso de precipitado, que es de la tripsina durante unos 4-6 segundos.
- A continuación el segundo vaso, que contiene la solución tampón pH 6.8, que amortiguara la acción de la tripsina. Metemos y sacamos los portas inmediatamente y después los sacudimos un poquito.
-Por último los introducimos en el vaso de precipitados que contiene el giemsa durante 2 minutos.
Cuando hallan pasado los dos minutos, los ponemos encima de las paralelas, que están en las cubetas, y lavamos el porta con agua destilada.
-Lo dejamos secar o lo secamos con papel de filtro (sin tocar la superficie donde están fijados los cromosomas).
**Si el bandeo se realiza el mismo día que la fijación hay que disminuir el tiempo de la tripsina a 2 segundos.
4.5. Análisis al microscopio
Vamos a visualizar las extensiones con el objetivo de 10X, para buscar las metafases. Una vez localizada la metafase, se coloca la misma en el centro del campo de visión, se gira el objetivo y se añade una gota de aceite de inmersión (que veremos con el objetivo de inmersión).
El objetivo de la observación de las metafases consiste en contar el número de cromosomas y comprobar que no tienen ninguna aneuploídia. Identificar los cromosomas mas sencillo por su tamaño y la posición del centrómero.
Nosotros no pudimos encontrar las metafases, así que no pudimos realizar el cariotipo. Pero pudimos ver algunos cromosomas que se tiñieron de giemsa y eran fáciles de distinguir.
5. PREGUNTAS
1. ¿ En que tipo de tejidos podemos encontrar células en división mitótica? ¿Porque se emplea sangre para la realización de la práctica?
Podemos encontrar células en división mitótica en la sangre, en la médula ósea, en biopsias epiteliales, líquido amniótico, vellosidades coriónicas...
Utilizamos sangre, porque es muy fácil de extraer.
2.¿En que condiciones debe cultivarse la muestra de sangre para poder visualizar los cromosomas?
Cuando la muestra de sangre esté mezclada con el medio de cultivo, se conservará en la estufa a 37ºC durante 72 horas.
3.¿Qué función tiene la colchicina?
Inhibe la aparición del huso acromático
4.¿Por qué aparecen bandas en el cromosomas después de tratarlo con tripsina?
Porque al teñirse el cromosoma, crea bandas oscuras y claras. En las zonas oscuras hay una gran mayoría de bases G-C y en las zonas claras destacan las bases A-T.
5.Para poder detectar una aneuplodía (Trisomía en el 21) ¿es necesario hacer un bandeo de los cromosomas?
No, ya que las mutaciones pueden detectarse en preparaciones citogenéticas mediante la observación de cromosomas metafásicos por microscopía óptica.
- Centrifugamos 5 minutos a 1000 r.p.m.
**Se repiten los pasos 7 y 8 del fijador dos o tres veces en total, o hasta que el precipitado esté bien
limpio y blanco. El sobrenadante debe quedar prácticamente transparente.
Para el tubo A, lo limpiamos y centrifugamos 5 veces en total.
Para el tubo B, lo limpiamos y centrifugamos 3 veces en total.
-Quitamos el sobrenadante con la pipeta A dejando aproximadamente 0,5 mL. Resuspendemos bien con la pipeta A.
-Hacemos las extensiones en portaobjetos limpios, que previamente han estado en un frasco con agua fría metidos en la nevera. Antes de hacer la extensiones etiquetamos cada porta con el nombre del grupo y el tubo al que pertenecen las muestras.
Echamos 4-5 gotas a una distancia de 5-10 cm, para que los linfocitos se rompan al impactar sobre el vidrio, liberando así el material cromosómico. Las gotas las echamos en el centro del porta y las dejamos resbalar inclinando el porta para que se extienda por toda la superficie.
Al porta A1 le echamos las gotas desde 20 cm de altura y al A2 desde 10 cm de altura.
Al porta B1 le echamos las gotas desde 20 cm de altura y al B2 desde 10 cm de altura.
4.4. Bandeo y tinción de los cromosomas
-Lo primero que tuvimos que hacer fue preparar la solución de bandeo mezclando el microtubo de tripsina con el buffer. También preparamos la solución de tampón pH 6.8 y la solución de giemsa.
Echamos las tres soluciones en tres vasos de precipitados y al lado pusimos tres cubetas con varias paralelas para después lavar los portas.
- Primero, con ayuda de una pinzas de madera agarramos los portas y los sumergimos de dos en dos en el primer vaso de precipitado, que es de la tripsina durante unos 4-6 segundos.
- A continuación el segundo vaso, que contiene la solución tampón pH 6.8, que amortiguara la acción de la tripsina. Metemos y sacamos los portas inmediatamente y después los sacudimos un poquito.
-Por último los introducimos en el vaso de precipitados que contiene el giemsa durante 2 minutos.
Cuando hallan pasado los dos minutos, los ponemos encima de las paralelas, que están en las cubetas, y lavamos el porta con agua destilada.
-Lo dejamos secar o lo secamos con papel de filtro (sin tocar la superficie donde están fijados los cromosomas).
**Si el bandeo se realiza el mismo día que la fijación hay que disminuir el tiempo de la tripsina a 2 segundos.
4.5. Análisis al microscopio
Vamos a visualizar las extensiones con el objetivo de 10X, para buscar las metafases. Una vez localizada la metafase, se coloca la misma en el centro del campo de visión, se gira el objetivo y se añade una gota de aceite de inmersión (que veremos con el objetivo de inmersión).
El objetivo de la observación de las metafases consiste en contar el número de cromosomas y comprobar que no tienen ninguna aneuploídia. Identificar los cromosomas mas sencillo por su tamaño y la posición del centrómero.
Nosotros no pudimos encontrar las metafases, así que no pudimos realizar el cariotipo. Pero pudimos ver algunos cromosomas que se tiñieron de giemsa y eran fáciles de distinguir.
5. PREGUNTAS
1. ¿ En que tipo de tejidos podemos encontrar células en división mitótica? ¿Porque se emplea sangre para la realización de la práctica?
Podemos encontrar células en división mitótica en la sangre, en la médula ósea, en biopsias epiteliales, líquido amniótico, vellosidades coriónicas...
Utilizamos sangre, porque es muy fácil de extraer.
2.¿En que condiciones debe cultivarse la muestra de sangre para poder visualizar los cromosomas?
Cuando la muestra de sangre esté mezclada con el medio de cultivo, se conservará en la estufa a 37ºC durante 72 horas.
3.¿Qué función tiene la colchicina?
Inhibe la aparición del huso acromático
4.¿Por qué aparecen bandas en el cromosomas después de tratarlo con tripsina?
Porque al teñirse el cromosoma, crea bandas oscuras y claras. En las zonas oscuras hay una gran mayoría de bases G-C y en las zonas claras destacan las bases A-T.
5.Para poder detectar una aneuplodía (Trisomía en el 21) ¿es necesario hacer un bandeo de los cromosomas?
No, ya que las mutaciones pueden detectarse en preparaciones citogenéticas mediante la observación de cromosomas metafásicos por microscopía óptica.
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