ADN/ARN MICROARRAYS

ADN/ARN MICROARRAYS 

Objetivo del experimento 

El objetivo de esta práctica es comprender la técnica de microarrays y conocer como se aplica la genómica funcional. Esta práctica consiste en una simulación en la que se analizaran cuatro conjuntos de muestras, también simuladas, de cuatro pacientes distintos para determinar diferentes niveles de expresión génica; se analizaran las diferencias de la expresión génica con un  microarray de dos colores. 

Componentes del kit 

• Cuatro muestras diferentes de microarrays Quickstrips

• Tarjeta de microarrays

**Todo este material deberá estar refrigerado en cuanto se reciba

Materiales (no suministrados)

• Micropipetas de volumen fijo ( 5 microlitros)

• Puntas de pipeta desechables 

• Transiluminador 

• Vaso de precipitados (rechazo)

Procedimiento de la práctica 

En esta práctica habrá 16 muestras diferentes que han sido preconvertidas en ADNc en presencia de un marcador fluorescente incorporado durante la síntesis. Las muestras de ADNc de los pacientes se mezclan previamente con con el ADNc marcados obtenidos a partir de células normales de control. Se podrán observar las muestras de las tarjetas de  microarrays en el orden establecido para cada paciente. Los puntos de muestreo de las tarjetas contienen fragmentos de ADNc sintetizados (por PCR) para cada uno de los ARNm de los pacientes. Las primeras cuatro muestras en cada microarray QuickStrip (A a D) son muestras de control, seguidas de cuatro muestras de pacientes (E a H). Las muestras de microarrays se marcan con una o varias líneas; por ejemplo,en las muestras del paciente 1 (una línea), Paciente 2 (dos líneas), y así sucesivamente.
 Para obtener resultados correctos, es esencial que tengamos una buena técnica de pipeteo y saber en todo momento que muestra estamos cogiendo y de que paciente es dicha muestra.

La técnica de microarrays detecta aumentos o descensos en la regulación de los genes basándose en la expresión del ARNm de la célula, este ARNm asociado a los pacientes se convierte en ADNc que está asociado a un marcador fluorescente rojo. Después se mezclan las dos muestras (paciente y control) y se hibridan a un chip de genes de microarrays. Después de la hibridación el chip de genes, se lee con ayuda de un transiluminador con fluorescencia.

Precauciones 
Aunque no se utilice material humano en esta práctica, debemos seguir unas pautas de seguridad :
- Usar guantes y gafas de laboratorio
- No pipetear con la boca
- Lavarse las manos antes de empezar la práctica y después de terminarla

Pasos a realizar 
1. Separamos las muestras con ayuda de unas tijeras y las marcamos con un rotulador. Al paciente 1, le marcamos con una línea, al paciente 2 con dos líneas, y así sucesivamente.
2. Cada grupo recibe un conjunto de 4 tiras de muestras, marcadas con el número de paciente que corresponda.
3. Golpeamos las tiras de las muestras contra las mesas, con golpes suaves. Así nos aseguramos que la muestra se quede en el fondo de los pocillos.
4. Tomamos una tarjeta de microarrays, en el que los puntos A-D representan a las muestras control y los puntos E-H representan a las muestras experimentales.
5. Con ayuda de la punta de la micropipeta, agujereamos la superficie de la tira de la muestra, teniendo cuidado de no tirar la muestra.
6. Pipeteamos la muestra y la depositamos en el círculo que corresponde en la tarjeta.
7. Cuando tengamos todas las muestras, depositamos la tarjeta en la incubadora a 37ºC durante 5 minutos, para que las muestras se sequen.
8. Visualizamos la tarjeta en un transiluminador con luz UV
9. Apuntamos los resultados y los analizamos.

DETERMINACIÓN DEL FACTOR Rh POR PCR

Cuaderno de prácticas- Biología molecular y citogenética                                      Práctica 5

DETERMINACIÓN DEL FACTOR Rh POR PCR 

El objetivo de este experimento es la determinación del Rh utilizando para ello técnicas de la PCR y de la electroforesis de ADN. Para ello, nosotros asilaremos el ADN de nuestra saliva y lo utilizaremos para llevar a cabo la reacción de PCR. La base de la práctica es la amplificación de un fragmento del gen D. La amplificación de este fragmento indicará que la persona es Rh+.

Debido a que los genes D y CE son altamente homólogos, es posibles diseñar cebadores que se emparejan en una región del gen D y también en una región del gen CE. De esta forma, los individuos Rh+ producirán 2 fragmentos de diferentes tamaños (1200 pb y 600 pb) correspondientes a los genes D y CE, mientras que los individuos Rh- producirán unúnico fragmento (1200 pb) correspondientes al gen CE. 

-DESARROLLO DE LA PRÁCTICA 

• EXTRACCIÓN DE ADN

Lo primero que debemos hacer es extaer una muestra de ADN bucal a partir de nuestra saliva. Nosotros hicimos esa práctica en el primer trimestre y congelamos las muestras hasta marzo, que  el mes en que empezamos la PCR. 

• AMPLIFICACIÓN POR PCR

Antes de empezar a realizar la PCR, hay que sacar las muestras del congelados y ponerlas en el baño termostático para descongelarlas.

-MATERIALES Y REACTIVOS 

• Mix PCR, es una master mix que ya contiene previamente mezclados todos los componentes de la PCR, conexcepción del ADN molde. También incluye el tampón de carga. 
• Control positivo 
• Agua destilada

-EQUIPOS 

• EPIS
• Termociclador 
• Tubos de 0,2 mL
• Micropipetas y puntas 
• Gradillas para los tubos de 0,2 mL

-PROCEDIMIENTO 

1. Marcamos los tubos con las iniciales de cada miembro del grupo, solo habrá cuatro muestras de ADN por grupo. Marcamos dos tubos más, uno como C+ (control positivo) y otro como C- (control negativo). 
2. En el tubo C- ponemos 22,5 microlitos de mix PCR y 2,5 microlitros de agua destilada.
3. En el tubo C+ ponemos 22,5 microlitros de mix PCR y 2.5 microlitros de control positivo.
4. En cada tubo de muestras marcado con las iniciales de los miembros del grupo, dipensamos 22,5 microlitros de mix PCR y 2.5 microlitros de ADN correspondiente a cada miembro del grupo. Mezclamos bien 

En nuestro grupo hubo un problema, fuimos los últimos y se gasto el mix PCR para el último tubo de muestra, así que solo tenemos tres tubos con muestras.

Además tampoco hicimos control positivo ni negativo, ya que tres grupos anteriores lo habían hecho y había de sobra para todos, ya que en cada pocillo solo caben 5 microlitos. 

Después de todo esto, metimos los tubos en el termociclador, que ya estaba programado a :

- 10 minutos 95ºC

-35 ciclos : 1 minuto a 95ºC, 1 minutos a 64ºC y 1 minuto a 72ºC.

-10 minutos a 72ºC

• ELECTROFORESIS E INTERPRETACIÓN 

En esta parte de la práctica desmoldaremos el gel de agarosa y llenaremos los pocillos con las muestras y los controles. Después realizaremos la electroforesis con la fuente de alimentación y veremos los resultados con el documentador de geles.

- MATERIALES Y REACTIVOS 

• Tampón TBE o TAE 
• Marcador Pm (escalera de ADN)
• Control + y -
• Agua destilada 
• Muestras de ADN 
• Colorante 

- EQUIPOS 

• Cubeta de electroforesis 
• Fuente de alimentación 
• Transiluminador 
• Documentador de geles
• Tubos de 0,2 mL 
• Gradilla para los tubos de 0,2 mL 
• Vaso de precipitados 
• Probeta de 1000 mL 
• Pipetas graduadas 
• Micropipetas y puntas 

-PROCEDIMIENTO 

• Preparación del gel, cargar de los pocillos y comienzo de la electroforesis

Lo primero que vamos a hacer es limpiar nuestros puestos de trabajo, ya que hay que trabajar con la técnica aséptica. Depués preparamos todos los materiales.

-Lo primero es sacar el gel de agarosa del frigo y desmoldarlo con mucho cuidado, porque se nos puede romper.

- Preparamos el tampón TAE 1X , ya que hemos hecho el gel al 1%. Como en el laboratorio teníamos tampón TAE al 10x ( que contiene tris, acetato y EDTA), hemos cogido una probeta de 1000 mL y hemos puesto 100 mL de tampón TAE y 900 mL de agua destilada. Una vez preparado lo hemos repartido entre todos los grupos.

-Para preparar la cubeta de electroforesis, primero hemos medido con agua destilada el volumen que le entrará a la cubeta de tampón TAE.
-Hemos echado el tampón en un vaso de precipitados de 250 mL y luego unos 100 mL más, lo suficiente para cubrir la cubeta y el gel.
-A continuación hemos metido el gel con el soporte

- Descongelamos la escalera de Beethoven en el baño termostatizado

-Después sacamos las muestras del termociclador y preparamos las micropipetas y las puntas para cargar los pocillos. Cogemos una micropipeta fija de 5 microlitos ( el volumen que se cogerá para  cada pocillo) y lo primero que cogemos es el control +  y lo echamos en el primer pocillo, después echamos la primera muestra de ADN y a continuación las dos siguientes, después el control - y por último la escalera de beethoven. Hay que tener mucho cuidado porque los pocillos son muy frágiles y no se pueden tocar, para eso hay que tener una buena técnica de pipeteo.

-Una vez los pocillos cargados, cerramos la cubeta y la enchufamos a la fuente de alimentación. Programamos la fuente a 150 voltios durante 30 minutos.

• Preparación del colorante blue bloots 

Para preparar el colorante, hemos necesitado 9,38 mL de colorante blue y hemos completado hasta 125 mL con agua destilada. Todo esto lo hemos depositado en una cubeta de plástico para que los geles pudieran caber.

• Teñido del gel de agarosa

Cuando han pasado los 30 minutos en los que el gel ha estado metido en la cubeta de electroforesis a 150 voltios y en los que se suponen que las muestras han corrido desde los pocillos hasta abajo (del negro al rojo), sacamos el gel.
Hemos recogido el gel con unos plásticos que hemos recortado para poder separarlos del soporte, y lo hemos depositado en la cubeta de plástico que contenía el colorante y lo hemos dejado teñir durante 10 minutos.
Después de los 10 minutos, lo hemos sacado con la ayuda de los plástico con los que los introdujimos, y lo hemos lavado con agua destilada. En el momento de lavarlo se ha caído un trozo, pero no ha pasado nada grave, porque las muestras habían corrido a través del gel.

• Observación del gel e interpretación de los resultados 

Una vez teñido el gel, lo hemos introducido en el transiluminador y en ese momento se nos ha partido por el trozo de los pocillos.
Lo hemos unido como hemos podido y lo hemos observado al transiluminador, pero no hemos visto gran cosa. Como no veíamos mucho, lo hemos metido en el documentador de geles y le hemos echado unas fotos, pero tampoco se veía mucho mas.
Cuando lo hemos sacado, se nos ha terminado de romper, porque el gel era ya demasiado frágil.
Como solo ha quedado un trozo pequeño, lo hemos puesto al trasluz y hemos podido ver como se han corrido las muestras y la escalera.
Así que aunque se nos haya roto hemos podido ver nuestras muestras, pero claro no hemos podido interpretar los resultados.

Al trasluz se veía así: